Microbiological Preparation and Testing Strategy in Pharmaceutical Industry

.

.

Mikrobiologi merupakan bagian dari Quality Control dan biasanya bergerak di manage quality of product and environment, karena harus memastikan mikrobiologi di lingkungan sekitar produk itu terkotol. Menggunakan utility (termasuk air yang digunakan untuk proses produksi, untuk proses pencampuran obat. Termasuk gas nitrogen dan gas-gas lain dalam Compressed air — sistem udara bertekanan) harus di-monitoring kontaminasi mikrobiologi nya.

.

Microbiology Testing (secara umum):

• Growth Promotion Test (GPT) → Untuk media
• Microbial Limit Test → Untuk produk atau material
• Bioburden Testing → Untuk produk atau desinfektan yang digunakan
• Bacterial Endotoxin Test (BET) → Jika material membutuhkan persyaratan anti/bebas pirogen, untuk produk yang menggunakan Water For Injection (WFI) biasanya diminta BET
• Sterility Testing → Untuk produk dan material (jika diperlukan)
• Potential Antibiotic/Bioassay Test → Untuk Raw Material maupun Finished Good yang ada kandungan antibiotik
• Environmental Monitoring → Di proses produksi dan di laboratorium tempat kita melakukan analisa
• Utility Monitoring → Monitor air dan kompres gas
• Microbial Identification → Lanjutan dari tes yang telah kita lakukan ataupun untuk persyaratan untuk material yang kita test yang tidak boleh ada patogen X.

.

Microbiology Lab Consider

Ada beberapa aspek yang perlu dipertimbangkan dalam laboratorium mikrobiologi yaitu:

• Personel/Sumber Daya Manusia (SDM)
• Lingkungan
• Metode
• Reagen atau medium kultur yang digunakan
• Pembersihan dan desinfeksi
• Penanganan pengambilan sampel
• Penanganan pencucian produksi
• Dokumentasi (ALCOA+)

.

Microbiology Lab Consider

Ada beberapa aspek yang perlu dipertimbangkan dalam laboratorium mikrobiologi yaitu:

1. Personel/Sumber Daya Manusia (SDM)
2. Lingkungan
3. Metode
4. Reagen atau medium kultur yang digunakan
5. Pembersihan dan desinfeksi
6. Penanganan pengambilan sampel
7. Penanganan pencucian produksi
8. Dokumentasi (ALCOA+)

.

1. Personel/Sumber Daya Manusia (SDM)

• Job Description → Saat karyawan melakukan testing memang harus sesuai dengan job description.
• Job Curricula → untuk memastikan personel sudah sesuai penugasan materi-materi untuk melakukan testing.
• Trainer
• Qualified
• Experience
• Gowning & PPE → harus memakai APD yang sesuai dan tepat.

.

2. Environment (Lingkungan)

a. Laboratorium Layout/Designed

• Ada pemisahan antara area satu dengan yang lain untuk meminimalisasi cross contamination di area laboratorium.
• Laboratorium mikro harus terpisah dengan lab produksi karena jika ada kontaminasi di laboratorium tidak sampai ke ruangan produksi, serta karena lab mikro sering menggunakan pengujian mikroba sehingga perlu setting terhadap Air Handling Unit (AHU) tertentu agar bersih dan terkontrol sistem udaranya untuk menghindari kontaminasi/pencemaran mikroba.
• Harus memiliki area yang cukup agar tidak terjadi mix up ataupun cross contamination.
• Material yang digunakan harus sanitary grade yang gampang dibersihkan dan didesinfeksi agar material yang digunakan tidak menjadi sumber kontaminasi ke produk. Misalnya beberapa material harus pakai sainlestill agar gampang dibersihkan.
• Akses masuk ke dalam laboratorium harus dibatasi (hanya orang-orang tertentu yang bisa masuk) agar meminimalkan kontaminasi.
• Area penyimpanan, area preparasi, area testing harus di segregasi.
• Peralatan lab yang digunakan harus selalu bersih, tidak boleh asal dipindahkan, harus berada dalam batas standar kalibrasi dan dilakukan preventive maintenance (jika sudah lewat dari tanggal kalibrasi tidak boleh digunakan).
• Harus menggunakan proper gowning dan personal hygiene.

b. Environmental monitoring laboratorium → untuk memastikan kondisi testing di laboratorium terkontrol. Terdapat beberapa pemeriksaan:

• Viable → Melihat kontaminasi di area laboratorium testing.
• Temperature harus terkontrol.
• Kelembaban relatif jika diperlukan.
• Differential pressure → jika memakai AHU maka perbedaan (kontrol) tekanan dari satu ruangan dengan ruang lain harus dimonitoring.
• Kriteria penerimaan dari monitoring lingkungan.
• Trending data → untuk melihat dan mengevaluasi performa lingkungan area laboratorium.

c. Cleaning, Disinfection and Hygiene terutama pada area testing → harus membuat program dan prosedur terkait:

• Prosedur cara pembersihan ruangan (berapa kali harus dibersihkan?), agen pembersihan (apa yang digunakan untuk proses pembersihan?)
• Bagaimana prosedur penggunaan desinfektan? desinfektan seperti apa yang digunakan?
• Bagaimana prosedur kebersihan? sering melakukan cuci tangan, no make up, tanpa makan dan minum di ruangan dll)
• Bagaimana prosedur jika terjadi tumpahan (reagen kimia yang berbahaya)

d. Sterility test facilities (untuk produk-produk tertentu)

• Saat melakukan proses sterilisasi pada produk harus melakukan teknik aseptik.
• Diberlakukan aliran udara searah pada area yang zona (kelas) A grade B background, biasanya memakai Isolator atau Restricted Access Barrier Systems-RABS (close system), Bio-Safety Cabinet (open system).
• Saat melakukan test sterilisasi harus dilakukan Environmental Monitoring (EM) untuk memastikan kondisi area kita melakukan tes tersebut terkontrol sehingga tidak ada kontaminan dari ruangan tersebut yang bisa mengakibatkan hasil uji sterilitas false positif (invalid result). Seperti Active Air (untuk monitoring udara), Passive Air, Surface, Operator’s glove prints (karyawan melakukan sterility testing juga dilakukan monitoring).
• Environmental Monitoring (EM) selalu dilakukan setiap sesi kerja beroperasi.

.

3. Methods & Reporting → Segala sesuatu yang kita kerjakan harus dilakukan:

• Metodenya sudah tervalidasi sebelum kita menggunakan testing secara rutin.
• Dibuat prosedur atau SOP yang dijadikan acuan testing secara rutin.
• Harus selalu update langkah-langkah pengerjaan ataupun hasilnya sehingga pekerjaan selanjutnya tidak menimbulkan kesalahan.
• Harus mudah dievaluasi atau diintervensikan oleh analis yang melakukan testing.
• Untuk laporan (data sheet) yang digunakan harus dalam bentuk user friendly.
• Laporan datanya harus tersedia dan gampang untuk dicari.

.

4. Material/reagen/media/cultures

• Harus digunakan dalam waktu shelf-life (rentang waktu merial yang aman digunakan) atau sebelum expired date.
• Harus disimpan dalam suhu yang sesuai kondisinya agar menghindari perubahan sifat properties dari material/reagen/media/cultures. Jikapun terjadi penyimpangan → dilakukan investigasi → jika ada justifikasi dari pihak manufakturing mereka akan memberikan pernyataan tertentu bahwa “storage acceptable yang disarankan seperti ini”.
• Penyimpanan (terutama reagen) harus berdasarkan compatibility dan tidak boleh digabung satu sama lain dan harus disesuaikan dengan karakteristik reagen/media, karena bisa menyebabkan bahaya jika reagen/media tidak digabungkan berdasarkan compatibility-nya.
• Harus ada pelabelan baik & benar (harus memuat identifikasi materialnya, waktu material dibuka kapan? waktu expired date kapan?) agar memudahkan analis dalam menggunakannya.
• Kultur mikroba harus sesuai dengan kebutuhan dan terstandar (sesuai USP, FI dll). Seperti di United States Pharmacopeia (USP) kita tidak boleh menggunakan lebih dari generasi ke 5 seed lot-nya.

.

5. Untuk penyimpanan Reagen & Culture

Penyimpanan stock harus dipisahkan dengan working stock sesuai FIFO atau FEFO agar memudahkan handing & management ketersediaan stock.

.

6. Handling

a. Sample Handling

Saat menerima sampel dari ruang produksi → sesuaikan dengan jenis & tipe sampel → dibawa ke preparasi area untuk pengerjaan → setelah selesai dianalisis → dibawa ke in progress area (menunggu hasil dari sampel apakah lulus uji atau tidak? apakah perlu investigasi?) → acc → disimpan pada sampel done area → jika sudah di release sampelnya → sisa sampah sampel akan dibuang (disposal).

b. Wash Handling

Pembuangan terbagi menjadi 3 kategori yaitu untuk pembuangan non-toksik, toksik dan biohazard. Pembuangan non-toksik dan toksik akan diatur oleh divisi lingkungan departemen Environmental, Health and Safety (EHS). Pembuangan biohazard dikelola dalam laboratorium menggunakan Autoklaf.

.

7. Testing preparation

Saat melakukan testing sampel ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dan pre-chek terlebih dahulu:

• Apakah personil (pekerja) sudah terkualifikasi?
• Apakah test method sudah tervalidasi? apakah SOP-nya sudah siap?
• Apakah materialnya sudah tersedia dan masih dalam masa penggunaan (shelf-life)? apakah materialnya cukup untuk digunakan dalam testing?
• Peralatan yang dibutuhkan sudah tervalidasi?
• Bagaimana menjamin keselamatan para pekerja testing? harus melihat Safety Data Sheet (SDS) atau Material Safety Data Sheet (MSDS). Contoh : Saat terjadi spill bagaimana? harus tau spill clean-up. APD apa yang harus dipakai saat testing?
• Saat melakukan testing juga menganalisis Hazard Identification Risk Analysis (HIRA) untuk menjamin keselamatan para pekerja → apa saja hazard yang muncul saat kegiatan testing? kontor-nya bagaimana?
• Apakah record untuk melampirkan data testing kita sudah siap?
• Apakah monitoring lingkunganya sudah terkontrol? apakah temperatur untuk ruangan testing sudah masuk spek? jika diluar spek maka kita tidak boleh melakukan pekerjaan testing.

Note:

• Jika sampel sudah diterima → kita akan sesegera mungkin mengerjakan secepatnya dan disesuaikan masing-masing lot tiap laboratorium-nya.
• Harus dilakukan inspect secara visual untuk melihat integritas dari sampel di kontainer primer sebelum melakukan analisa → dilakukan pengecekan agar sampel memenuhi spesifikasi atau tidak? jika tidak memenuhi spesifikasi karena faktor apa? apakah kebocoran? sampel tidak tertutup rapat dari kontainernya?
• Jika di kontainer produk tersebut sudah ada terlihat kerusakan atau ada identitas yang tidak terbaca → tidak boleh diteruskan proses testing sampel.
• Dalam proses pengerjaan selalu ada identitas sampel yang mudah ditelusuri (siapa yang melakukan analisa? nama sampelnya apa? batch berapa? tanggal berapa dikerjakan?) → jika terjadi Out Of Specification (OOS) maka akan mudah ditelusuri permasalahanya.
• Sampel harus selalu dilakukan sanitasi (desinfeksi bagian luar sampel) karena untuk meminimalisir sumber kontaminan saat kita melakukan pengerjaan testing.
• Lakukan pengerjaan testing di dalam Laminar Air Flow (LAF) ataupun Bio Safety Cabinet (BSC) atau di sterility test isolator.
• Saat membuka kontainer sampel harus dilakukan secara aseptik, melakukan penimbangan harus di dalam LAF jangan di dalam oven di area yang tidak bersih (black area).
• Saat melakukan analisa, jangan lupa monitoring viabel untuk mengetahui apakah lingkungan menjadi sumber kontaminan atau tidak → memudahkan investigasi jika ada permasalahan.
• Negatif kontrol harus selalu ada untuk membandingkan hasil sampel Vs negative control → memudahkan untuk memastikan bahwa media yang digunakan adalah sumber kontaminasi saat melakukan analisa atau bukan?

.

Media yang digunakan dalam Mikrobiologi testing → Dalam pengerjaan tes mikrobiologi tidak bisa lepas dari penggunaan media (baik media siap dipakai/ready to use atau media yang harus dibuat sendiri/dehydrated media powder). Kedua media tersebut tetap perlu dilakukan Growth Promoting Testing sebelum analisa sampel → Gunanya untuk memastikan media yang kita akan digunakan sudah benar/sesuai untuk menumbuhkan mikroba (Fertil Steril). → Jika media tidak fertill, maka tidak akan ada pertumbuhan mikroba di media yang digunakan, bukan karena ada kontaminan tapi media kita yang tidak fertill.

Growth Promoting Testing (GPT)

• Tipe media GPT ada yang solid dan liquid, keduanya harus dilakukan GPT.
• Preparasi medianya mengikuti apa yang tertulis di manufacture instruction.
• Medianya harus lolos release terlebih dahulu, sebelum digunakan untuk GPT.
• Dalam melakukan GPT juga menggunakan mikroba yang terstandar di USP → 5 mikroorganisme di tabel beserta dengan ATCC-nya.
• Inoculum yang digunakan dalam GPT tidak boleh lebih dari 100 CFU mikroorganisme-nya/mL.
• Mikroorganisme yang digunakan, tergantung organisasi yang memilih, apakah menggunakan yang ready to use (per mL sudah 100 CFU mikroorganisme) agar lebih efektif & efisien bagi analis? atau ingin membuat sendiri? Misalnya Agar Seln dengan membuat sendiri → harus dihitung terlebih dahulu populasinya oleh internal lab → sehingga harus melewati proses serial dilution method (pengenceran 10¹ sampai 10⁷) → di pengenceran berapa populasi mikroorganisme yang mendekati (kurang dari) 100 CFU → Pengenceran tersebut yang akan digunakan untuk test media.
• Strain mikroorganisme yang digunakan tidak boleh lebih dari fase ke 5 dari referensi stock culture.
• Dalam pengerjaan Growth Promotion Testing juga harus dibandingkan dengan media approval → kemudian pengerjaan testing harus paralel antara batch baru dengan batch sebelumnya.

Media yang digunakan harus:

• Purchased Compendial Microorganisms → mikroorganisme yang digunakan harus sesuai standar kompendial.
• New Batch of Medium → media yang akan digunakan untuk GPT.
• Previously Approved Batch of Medium → medium yang sudah melewati test GPT (media sudah di release).
• Non-Selective Agar if Testing Liquid Medium.
• Calibrated Micropipette → harus menggunakan mikropipet yang terkalibrasi.
• Spreader for Distributing The Inoculum.
• Vortex Mixer → untuk membantu homogenisasi inocolum yang akan digunakan.

.

Growth Promoting Testing (GPT) Ready To Use

a. Media yang solid → saat membandingkan approve medium Vs new batch medium → hasil dari new bach medium harus faktor 2 dari media yang sebelumnya → misal: di media sebelumnya 40 koloni maka di media baru (new batch) harus tumbuh antara 20 (faktor 2 kali ke bawah) sampai 80 (faktor 2 kali ke atas) dari faktor medium sebelumnya. Medium harus kurang dari 100 koloni yang tumbuh.

• Media yang solid caranya : memasukan palet ke diluent → dicampur & di-homogenisasi-kan → tunggu 30 menit → maka populasi yang ada di diluent akan kurang dari 100 CFU koloni → kita ambil sesuai instruksi 0,1 mL ke media yang akan kita GPT → dilakukan inkubasi → pembacaan data dilakukan setelah inkubasi.

b. Media yang liquid → lebih fokus untuk identifikasi turbidity (melihat apakah ada pertumbuhan mikroba koloni atau tidak?) → hanya sebagai konfirmasi bahwa media yg digunakan sudah tumbuh koloni kurang dari 100 koloni. Contoh media, mikroorganisme yang digunakan, temperatur dan masa inkubasi bisa di cek pada tabel.

• Media yang liquid caranya : Tambahkan ke media liquid → plating liquid ke media agar untuk memastikan inokulum yang tumbuh benar.

.

Preparasi sampel analisis mikroba:

Sampel memiliki berbagai sifat → Water-soluble product for micro test (Larut dalam air), Non-fatty product insoluble in water (tidak larut dalam air), Fatty production microtest (tidak larut dalam air), Fluids or solid in aerosol from for micro test.

Water-Soluble Product for Micro Test (larut dalam air),

• Sampel yang digunakan 10 gr dimasukan dalam 90 ml diluent (buffer fosfat atau Soybean Casein Broth.
• Ph harus dalam rentang 6 sampai 8.
• Penambahan diluent lain (sealer dilution) jika diperlukan.

.

Microbial Limit Test (MLT)/ Enumeration

• MLT biasa dilakukan pada produk yang tidak steril seperti produk jadi (finished good), bahan baku (raw material) dan air (water).
• Melakukan MLT harus menggunakan metode yang sudah tervalidasi atau berdasarkan Pharmacopeial.
• Dalam pengujian MLT biasanya dilakukan pengecekan terhadap total kapang dan khamir — Total Yeast & Mold Count (TYMC) dan total mikroba aerob — Total Aerobic Microbial Count (TAMC) dan test specified microorganisms untuk material/produk yang tidak boleh ada patogen (e.coli, salmonella, pseudomonas aeruginosa, staphylococcus aureus) →testing akan lajut menggunakan media selektif.
• MLT akan mengevaluasi 2 hal yaitu kualitatif dan kuantitatif.
• MLT Kualitatif → untuk melihat pertumbuhan patogen mikroorganisme pada media selektif
• MLT Kuantitatif →untuk menghitung berapa jumlah kontaminan mikroba aerob dan fungi yang ada di sampel → hasilnya akan ditotalkan → didapatlah total microbial count.
• MLT terdapat beberapa metode yang sesuai kebutuhan → Filtration Method, Pour Plate Method, dan Spread Plate Method → disesuaikan berdasarkan metode validasi (melakukan trial and error) tergantung karakteristik sampel

1. Filtration Method → untuk air

• Menggunakan membran 0,45 mikrometer (umum digunakan) → dengan ukuran saringan filtrasi tersebut akan menyaring mikroorganisme kontaminan di dalam sampel.
• Membran juga memiliki variasi, tergantung karakteristik tiap sampel → sehingga pemilihan membran juga penting, apakah kita menggunakan cellulose acetate atau cellulose nitrat?
• Cara pengerjaan : sampel harus dilakukan diluent terlebih dahulu → kemudian kita memilih media yang cocok untuk isolasi dan enumerasi → dipasang filternya secara aseptik → sampel yang telah dilarutkan (diluent) masukan kedalam filter dan disaring → kemudian diambil lagi filternya (setelah selesai proses penyaringan) → filter tersebut diletakan ke dalam media padat & letakan pada bagian tengah media yang sudah disiapkan → dilakukan inkubasi sesuai dengan suhu & waktu yang sudah ditetapkan → perhitungan mikroorganisme berdasarkan yang teridentifikasi yang ada di filter menggunakan Colony Counter atau manual (jika di luar filter terdapat mikroorganisme disebut kontaminan) → hasilnya di dokumentasikan record ADR
• Kelebihan metode filtrasi : 1) Hanya cocok digunakan cairan yang tidak keruh & tidak kental untuk dilewatkan ke membran filter. 2) Metodenya tidak mahal. 3) Dapat menyaring 90–100% patogen/sampel kontaminan di sampel. 4) Secara energi penggunaan metode ini juga sangat efisien. 5) tidak mengakibatkan denaturasi protein. media yang punya sensitivitas terhadap panas sangat cocok disterilkan dengan metode filtrasi. Isolasi dan perhitungan koloni bakteri yang tumbuh akan mudah dilihat karena hanya koloni yg tumbuh di area disk yang dibaca.
• Keterbatasan metode filtrasi : 1) Jika sampel kita keruh dan kental sangat sulit menggunakan filtrasi. 2) Penggunaan gelas filter dari alat filtrasi ini mempunyai resiko pecah namun ada juga gelas filter yang disposable (sekali pakai). 3) Membran filter juga mempunyai resiko gampang rusak ketika sampel dilewatkan dalam jumlah banyak.

.

2. Pour Plate Method

• Pour Plate Method → yang paling umum dan banyak digunakan untuk product dan raw material
• Teknik Pour Plate: Ambil sampel sebanyak 1 ml → langsung dimasukan dalam petridish yang kosong → kemudian akan dicampur dengan media (15–20 ml) → di mix hingga homogen sampel & media → inkubasi cawan secara terbalik dalam inkubator sesuaikan temperatur dan waktunya → dilakukan observasi dan hitung jumlah koloni → lakukan record data & dokumentasi
• Syarat:

1. Sampel harus berbentuk liquid atau suspensi untuk bisa di mix dengan media
2. menggunakan media solid yang sesuai Tryptic Soy Agar (TSA) atau Sabouraud Dextrose Agar (SDA)
3. Petridish (umumnya ukuran 10 cm) harus steril → petri dish berbentuk kaca biasanya harus disterilkan terlebih dahulu, namun petri dish berbentuk plastik tersedia sudah steril (disposable) tinggal langsung pakai dan tidak perlu disterilisasi lagi serta lebih efisien.
4. Test tubes (jika memerlukan).
5. Pembuatan diluent bisa menggunakan air destilasi steril/buffer/Broth steril
6. Mikropipet atau graduated pipet harus terkalibrasi.

• Keuntungan : 1) Sangat mudah dilakukan karena hanya perlu mem-pipet 1 ml sampel dan tambahkan media lalu inkubasi. 2) Tidak perlu menggunakan media sebelumnya, tapi hanya menggunakan media yang sudah ter-GPT. 3) Tidak perlu melakukan inokulasi karena sampel tinggal dituangkan ke dalam agar (hanya perlu diperhatikan cara mix sampel-agar supaya tidak mengenai dinding-dinding luar atas atau kaca penutup petridish). 4) Meskipun dalam sampel jumlah kontaminan sangat rendah, namun masih bisa dideteksi dan bisa mengkalkulasi mikroba yang tumbuh di permukaan agar. 5) Semua jenis sampel bisa menggunakan metode ini.
• Keterbatasan: 1) Jika bentuk sampel solid atau semi solid maka harus dilarutkan/ disuspensikan terlebih dahulu agar bisa di pipet. 2) Jika tingkat kontaminan di sampel tinggi kita bisa melakukan serial dilution sehingga mudah menghitung koloni. 3) Saat sampel dicampur dengan media → media pun harus dijaga suhunya sekitar 40–45% (jika media sensitif terhadap panas tinggi maka koloni bisa tidak tumbuh). 4) Koloni terbentuk cenderung kecil karena sampel mikroba di mix dengan media sehingga koloni tersebar di berbagai tempat media bukan hanya di permukaan saja. 5) Untuk obligat aerob akan susah tumbuh koloni di bagian bawah media.

.

3. Spread Plate Method

• Cara teknik Spread Plate: Setelah sampel dipreparasi → ambil 0,1 ml sampel kemudian di transfer ke media agar yang sudah steril → di sebar sampel menggunakan spreader (L atau segitiga) → diinkubasi dengan waktu dan temperatur yang diperlukan → dilakukan observasi terhadap hasil koloni dan dokumentasi
• Syarat: (sama dengan pour plate methods)
• Keuntungan: 1) kontaminan yang rendah dalam sampel masih bisa dideteksi. 2) Morfologi koloni bisa lebih besar dan terlihat dst.
• Keterbatasan : 1) penggunaan spreader harus diperhatikan karena penggunaan spreader beda-beda tiap sampel, jika harus dilakukan sterilisasi panas (bunsen burner) harus pembakaran sempurna karena jika tidak akan tumbuh kontaminan atau pertumbuhan koloni sampel terganggu dst.

.

Sterility Testing (hanya untuk bahan atau produk yang steril)

• Test dilakukan dalam kondisi aseptik (didalam isolator) → semua material, sample, testing sudah dimasukan ke dalam isolator menggunakan tangan kita (close system).
• Media (untuk aerob, anaerob, fungi) yang akan digunakan sudah approve GPT → media Fluid Thioglycollate Medium (FTM) untuk pertumbuhan bakteri aerob dan anaerob dengan inkubasi di suhu 30–35°C. Sedangkan media Soybean Digest Casein/Tryptic Soy Broth (TSB) medium untuk pertumbuhan jamur dan bakteri aerobic dengan inkubasi di suhu 20–25°C. → masa inkubasi dalam waktu 14 hari.
• Diluen dan cairan pembilas untuk membran filtrasi harus disesuaikan dengan aturan USP.
• Harus ada negatif kontrol dari media yang digunakan.
• Mikroorganisme untuk melakukan validasi biasanya butuh lebih banyak mikroba (aerob, anaerob dan fungi) dibandingkan GPT.
• Jika menggunakan cara testing yang langsung dari USP → tinggal di verifikasi saja metodenya. namun jika kita melakukan modifikasi testing karena karakteristik sampel kita yang agak berbeda dari umumnya → maka perlu dilakukan validasi metode yang kita rancang.
• Metode :

1. Membrane filter → menggunakan membran ukuran 0,45 mikrometer. Membran selulosa nitrat untuk sampel larut air, oily, weak alkohol solution. Membran cellulose acetat untuk sampel strongly alcohol solution. Caranya: filter terlebih dahulu sampel → hasil filter dipindahkan ke media cair FTM atau TSB → inkubasi selama 14 hari.

2. Direct Inoculation → ambil volume sampel 10% dari medium yang digunakan → langsung campur sampel dengan media → dilakukan inkubasi.

Saat melakukan sterility test → observasi secara interval:

• Misalnya sampel harus diinkubasi selama 14 hari → maka observasi harus dilakukan dari hari pertama sampai 14 hari, namun juga didesain apakah harus observasi setiap hari atau per dua hari sekali → tujuannya: agar melihat kesterilan sampel kita atau sudah tidak teril selama 14 hari itu → jika di hari kedua atau ketiga, media sudah mulai turbid (keruh) berarti sampel kta sudah terkontaminasi atau sudah tidak steril → perlu dilakukan investigasi yang prosedurnya disesuaikan dari organisasi masing-masing.